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胃癌病人外周血CK20mRNA表达与透明质酸浓度变化的

发布时间:2021-10-14

  张家胜到黄冈师范学院讲授思想政治理论!山东大学硕士学位论文胃癌病人外周血CK20mRNA表达与透明质酸浓度变化的研究姓名:王庆才申请学位级别:硕士专业:内科消化指导教师:赵幼安2000.12.1 胃癌病人外周血CK20mRNA表达与透明质酸浓度变化的研究内科消化专业研究生:王庆才导师:赵幼安前言胃癌是世界上十大恶性肿瘤之一,在我国的死亡率居各种癌症之首,全国年死亡率男性为20.93/10万,女性为10.16/10万;中国在世界范围内属于胃癌高发地区。外科手术仍然是目前治疗胃癌的主要方法,也是有可能治愈胃癌的唯一途径,但是手术作为一种局部治疗的手段也有其不足之处。导致手术失败的原因主要有三:一是手术时病变多已属中晚...

  山东大学硕士学位论文胃癌病人外周血CK20mRNA表达与透明质酸浓度变化的研究姓名:王庆才申请学位级别:硕士专业:内科消化指导教师:赵幼安2000.12.1 胃癌病人外周血CK20mRNA表达与透明质酸浓度变化的研究内科消化专业研究生:王庆才导师:赵幼安前言胃癌是世界上十大恶性肿瘤之一,在我国的死亡率居各种癌症之首,全国年死亡率男性为20.93/10万,女性为10.16/10万;中国在世界范围内属于胃癌高发地区。外科手术仍然是目前治疗胃癌的主要方法,也是有可能治愈胃癌的唯一途径,但是手术作为一种局部治疗的手段也有其不足之处。导致手术失败的原因主要有三:一是手术时病变多已属中晚期,已有远处转移或局部病变有广泛浸润累及重要脏器,以致无法施行病变彻底清除术。其次,手术不能切除时可能已存在亚临床转移灶。另外,手术操作本身也有可能促使肿瘤细胞扩散转移。只有明确地判断肿瘤转移与否、转移途径及范围,才能制订出更为合理的手术方案,也才能予以及时的辅助治疗。然而常规病理实验诊断技术以及目前的影像学技术,还不能确定和发现肿瘤细胞的微小转移灶及血循环中的游离瘤细胞。假若血1 循环中的胃癌细胞能在治疗前就被检出,对胃癌的治疗将起很大的帮助作用。对于胃癌切除术后血液中存在的胃癌细胞进行检测,可提高胃癌术后复发或转移的检出。由于血循环中的肿瘤细胞数量极少,检测十分困难。对肿瘤病人外周血癌细胞的检测有许多方法,但大多数敏感性和特异性较差,不能得到可靠的结果(1--3)。近年来,逆转录.聚合酶链反应( ReverseTranscri pti on Pol ymeraseChai nReacti on,RT-PCR) 技术的广泛应用,使得肿瘤的转移检测更准确、更灵敏、更方便。RT-PCR技术检测肿瘤细胞特异性基因较检测肿瘤蛋白质抗原更具有敏感性,其敏感性可达到每5ML全血中仅有1个癌细胞即可被辨认,这是一般免疫细胞学方法或免疫组化法所无法达到的检测水平。许多上皮来源的癌细胞如胃癌、大肠癌、乳腺癌等,均保留了上皮细胞的部分特征,细胞角蛋白( Cytokerati ns) 是上皮细胞的特征之一,它们是分布于上皮细胞的中间纤维丝,包括至少20个成员 钔。其中细胞角蛋白20( CK20) 有严格的上皮特异性分布,非上皮来源的组织或细胞如正常血液骨髓及淋巴结不表达CK20,因而可做为检测血液、淋巴结中上皮性肿瘤转移的标志。2 透明质酸( Hyal uroni c Aci d,HA) 是糖胺多糖( Gl yoosami nogl yoan,GAG) 中含量最多、最重要的一种,HA在机体的许多发育和调控过程,如细胞黏附、器官形成、创伤愈合、肿瘤发生和血管形成中,起着重要作用,大量HA抑制肿瘤宿主的细胞和体液免疫功能,目前认为HA是恶性肿瘤的标记物之一(。本研究应用RT-PCR方法测定胃癌外周血CK20、采用放射免疫分析法测定透明质酸,旨在进一步阐明CK20与透明质酸在胃癌诊断分期、判定早期微转移及复发中的临床意义,同时了解CK20表达和透明质酸不同浓度之间的关系,以及与胃癌分期关系及对预后的影响,从而进一步指导临床综合治疗。.临床材料1.病例选择:收集1999年11月至2000年11月经胃镜活检及手术病理证实为胃癌55例。同期胃炎及胃溃疡46例。55例胃癌中,男性45例,女性10例。年龄最小36岁,最大79岁,平均57.5岁。入选的55例胃癌均无慢性肝病及肾功不全史。45例B超CT等影像学检查未见有明显的转移灶。2.分组:①正常对照组:选择正常献血员50例为测定CK20{ 与HA的正常对照;②实体标本组:应用胃癌组织及良性胃病胃粘膜组织,通过检测其CK20mRNA表达,建立实验方法;⑨胃癌组:分早期、I、II、Il l 、IV期,术前采集外周血。④良性胃病组。实验方法RTuPCR法检测CK20础NA一、样品的采集和保存1.血标本的采集:采取胃癌病人外周静脉血5mi ,放入20u/m1肝素处理的防凝试管内,立即送到实验室,并于30分钟内分离出单个核细胞,放入一80。C冰箱保存备测。外周血单个核细胞的分离:取抗凝血I份,用吸管小心加于盛有等量的淋巴细胞分离液的离心管液面上,放入水平离心机内,以1500转/分离心20分钟。用吸管小心收集界面的细胞,放入含生理盐水5mi 试管中,用吸管吹打,充分混匀后,放入离心机,以2000转/分离心10分钟,用吸管吸去上清液,弃掉。所得沉淀物经生理盐水反复洗涤两次后,即得所需单个核细胞。同法采取良性胃病病人及正常献血员外周血5ml ,作以上相同处理。4 2.实体标本的来源:胃癌组织取自胃癌病人手术后癌组织及胃镜下活检组织,胃炎及胃溃疡病人粘膜组织在胃镜下取出。标本30分钟内送实验室,新鲜提取总RNA;不能保证30分钟内制备的样品,在接取后放一80。C冰箱保存备测。二、试验试剂配制、来源1、变性缓冲液( guani di ni umi sothi ocyanate,GIT)4mol /l 异硫氰酸胍;25mmol /l 柠檬酸钠(PH7.O);0.85%十二烷基肌氨酸钠;0.i mol /l B一巯基乙醇。取509异硫氰酸●胍溶于58ml 无RNA酶水中,加入3.52mi 0.75mol /l 的柠檬酸钠(PH7.O)和5.28m110%十二烷基肌氨酸钠,于65C溶解后,加入0.72ml B一巯基已醇,存放于4℃。2、无RNA酶水的配制:三蒸水加入O.1%DEPC( 焦碳酸二乙酯) ,37C放置1216h,再高压灭菌30分钟,去除残留的DEPC。3、O.75m01几柠檬酸钠(PH7.0):称取柠檬酸钠229,溶于80ml 水中,用浓盐酸调PH至7.0,加三蒸水至l OOml ,高压灭菌。4、10%十二烷基肌氨酸钠:称取十二烷基肌氨酸钠59溶于三蒸水中,加0.I%DEPC过夜处理,然后高压灭菌,去除S 残留的DEPC。5、2mol /INaAc( PH4.0) :称取NaAcl 6.4069溶于40ml 无RNA酶水中,用盐酸调PH至4.0,加无RNA酶水至l OOml ,高压灭菌。6、水饱和酚( PH4.0) :取重蒸酚200ml ,于65℃水浴中溶解,加入等体积的经DEPC处理过的三蒸水,再用2mol /INoAc调至PH4.0,震荡混匀,静置,酚相与水相完全分开后,4。C保存备用。7、焦碳酸二乙酯( DEPC) :中国医学科学院血研所科技公司提供,0.I%DEPC配制:0.5ml DEPC溶于500ml 三蒸水中,4C保存。8、溴酚蓝:中国医学科学院血研所科技公司提供,Si gma分装。0.25%溴酚蓝配制:250mg溴酚蓝溶于l OOml 三蒸水。9、氯仿( 三氯甲烷)国营山东单县有机化工厂提供。1 o、异丙醇:山东省化学研究所提供。1 1、无水乙醇:济南天桥精细化学品公司。l 2、琼脂糖:上河源聚生物科技有限公司。1 3、三羟甲基氨基甲烷( Tri s) Si gma分装。l 4、溴化乙锭( EB) :中国医学科学院血研所科技公司,6 Si gma分装。l Omg/ml EB配制:l OOmggB溶于l Oml 三蒸水。1 5、CK-20及B--acti n基因引物由宝生物工程( 大连)有限公司合成提供。l 6、RT-PCR反应所需试剂盒由宝生物工程( 3v连) 有限公司提供。1 7、淋巴细胞分离液:由TBD生物技术发展公司提供。l8、50xTAE:Tri s 60.59,Na2EDTA 9.39,冰醋酸14.275mi ,加水至250mi :用时稀释至l xTAE三、实验仪器1、PCR扩增仪480:PERKIN-ELMER,美国进口.2、753BI微机型紫外可见分光光度计:上海光学仪器厂3、数字图像分析仪2200:美国Al phaInnotechCorporati on4、微量高速离心机TGL一16B:广东5、HV3000多用电泳仪:DF一}Iv一3000北京东方特力科贸中心6、wH一2微型旋涡混合仪:上海沪西分析仪器厂7、一80C冰箱:日本三洋四、实验物品去RNase( 核糖核酸酶) 处理:7 1、玻璃器皿:洗涤剂清洗干净,稀酸处理过夜,清水冲洗干净,再用蒸馏水冲洗干净。使用前180。C干燥4小时。2、塑料器1111:1.5ml ,0.5ml Eppendorf管,微量移液器的大、中、小吸头为一次性使用,使用前进行高压消毒,重复使用的器皿常规洗净后于0.I%DEPC水溶液中37℃浸泡4小时,然后高压除去残留的DEPC。3、电泳槽的去RNase处理:应用去污剂洗涤以后,用清水洗干净,然后用无水乙醇干燥,再将电泳槽浸泡于3%H202溶液中30分钟,室温下放置10分钟,然后应用0.1%DEPC处理过的三蒸水彻底冲洗电泳槽后备用。五、琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖1.59,加入TAE电泳液l OOml ,微波溶解,然后加入l Omg/ml 溴化乙锭3p1,即得1.5%琼脂糖凝胶,4C保存备用。六、实验操作方法、步骤:(_)提取总RNAl 、从一80℃冰箱内取保存备用的l OOmg实体标本,放入一次性培养皿内,用PBS缓冲液冲洗。用精细剪刀将之剪碎后,用微量移液器加入已备制好的GIT变性液500pi ,使之混悬,放入匀浆器内匀浆,将匀浆物移入1.5ml Eppendorf管中。R 若为抗凝血标本,将分离出的单个核细胞,直接加入500pl变性液。加入50pl NaOAc( 2mol /L) ,500pl 水饱和酚,100pl 氯仿,每步均需混匀。旋涡震荡器混匀10秒钟。冰浴5-15分钟。2、沉淀RNA:4C10000转/分离心10分钟。吸取上清移入新Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,-20。C放置1h。4C12000转/分离心l O分钟。弃上清,加入100}l IGIT液,吹打,使沉淀溶解,加入等体积异丙醇,-20C放置l h。4C12000转/分离心20分钟。弃上清,用75%/, 醇洗一遍。至此可加入l ml 无水乙醇于-80C保存备用,亦可直接凉干,溶于无RNase的去离子水中。3、RNA纯度狈撼糯腿黼20旧Oo懈,以三蒸水作空白对照,用紫外分光光度计测出^260及脚的值,计算^260/^280的比疽。纯烈~样品的^260! 偿280比直为1.7_2.0,较氆匦匕值密盛宝近2-0;如低于1.7贝蝇剩蒴襁白国鹋滟应注哆处蹩猜用。黝腿应相吲舶怃I№e环宽隘避免肌降。应瞻獬中J掰鼢捌稚渐境和4℃叼虢保证反嘲碰勤雠毗㈢、逆转录(RT)反应:于DEPC处理的0.5ml Eppendorf管中,按表1加入所示试剂。O 逆转录( RT) 反应体系试剂名称用量MgCl 2l OxRNA PCR BufferRNase Free dH20dNTP Mi xtureRNase Inhi bi torRandom 9mersReverse Tr8nscri Dtase实验样品4u l2u 18.5 u12u 10.5u11 u 11 u 11 u 1( 或1 ug totalRNA)快速离心混匀。按以下条件进行逆转录反应。30℃l Omi n42℃15mi n~30mi n99℃5mi n5℃5mi n快速离心使蒸气沉于管底。o、PCR反应l 、反应体系:于0.5ml Eppendorf管中加入表2所示试10 表2PCR反应体系试剂名称用量MgCl 2IOxRNA PCR Buf f er灭菌蒸馏水TaKaRa Taq酶CK一20上游Pcl 【引物cK一20下游PCR引物Bacti n上游引物Bacti n下游引物6 u 18u l61_5ul0.5ul1 u l1Ⅱl1u 11Ⅱ1CK一20上游PCR引物序列:5cK一20下游PCR引物序列:5Bacti n上游引物序列:5Bacti n下游引物序列:5_cAGAcAcAcGGTGAAcTATGG一3_GATcAGcTTcCACTGTTAGACG一3_G弼6GGcGCCccAGGCACCA-3书ccnm讯CACGCA娲鼹nc-3快速离心混匀。把上述反应液加入到逆转录结束后的PCR反应管中,快速离心混匀。加入50D1液体石蜡。2、循环条件:Bacti n:94℃2mi nCK一20:94℃30sec60℃30sec72℃1.5mi n72℃7mi n四、电泳鉴定结果30个循环1.5%琼脂糖凝胶:1.59琼脂糖+IOOml TAE,微波炉 溶解,加入3pl l Omg/ml EB,摇匀,凉至50℃左右,制胶。加样:以0.25%溴酚蓝作电泳指示剂。电泳:电压75v,电流70MA,从负一一正,30分钟。图像分析仪观察结果。血清IIA检测法:血清HA定量测定采用放射免疫分析法,药盒由上海海军医学研究所提供。测定盒采用双抗体法,第二抗体作为分离剂,测定范围为O---800ng/ml ,每只测定盒可测100管。同一批号试剂盒测定。1.组成( 1) HA标准:6瓶( 0,50,100,200,400,800ng/m1)( 2) 试剂l :1瓶( HABP)( 3) 125I标记物:1瓶,为冰干品,用l Oml 生理盐水溶解( 4) 第一抗体:l 瓶( 5) 第二抗体:l 瓶( 6) HA质控血清( 批号1614--9909) :为冻干品,使用前分别加o.5ml 蒸馏水充分溶解约30分钟,分装.20C备用,允许值为:低值91.8~124.2 ng/ml ,中值173.3~234.6 ng/ml ,高值312.9~423.2ng/ml 。12 2.操作步骤:( 1) 设非特异结合管、标准品管及待测样品管,均做复管;( 2) 标准管加标准液100J .tl ,样品管加血清100pl ;(3)非特异管加0标准液2001xl ,其他管加试剂1溶液100pl ;( 4) 混匀,37℃水浴I小时;(5)加125I标记物1001al ,37C7](浴30分钟;(6)加第一抗体100I.tl ,37C水浴30分钟;(7)加第二抗体100I.d,3TC水浴30分钟;( 8) 用DDL_5冷冻离心机( 上海安亭科学仪器厂) 离( 4000转/分,15分钟) ,弃上清液,用FJ 2003A放射免疫Y计数器( 陕西西安262厂) 测量沉淀物放射性( B) 。3.数据处理:以HA标准浓度为横坐标,相应管的放射性计数与零标准管的放射性计数比值为纵坐标,用Logi t-Log方式拟合标准曲线,由放免分析仪计算出各标本的HA浓度。统计处理:用POMS2.00医学统计软件包进行数据处理,通过比较各组之间CK20阳性率以及HA浓度的不同,分析上述指标在胃癌诊断分期、早期微转移及复发中所起的作用,从而有助于早期诊断及对预后的判断。13 实验结果CK20mRNA测定结果:1.外周血CK20mRNA表达情况见表3表3胃癌、良性胃病组及正常献血员外周血CK20mRNA表达况情( 例数)CK20阳性CK20阴性胃癌组:良性胃病组正常献血员35(63.6啪OO20( 36.40/o)4650胃癌组与良性胃病组比较:x2--44.80PO.01胃癌组与正常献血员比较:x2_瓤厉PO.012.外周血CK20mRNA表达与胃癌临床病理的关系见表4表4胃癌不同部位、不同分期和不同病理的外周血CK20mRNA表达情况( 例数)CK20阳性CK20阴性部位胃底责门胃体胃窦分期早期IIIl IIIV病理低、未分化腺癌高、中分化腺癌早期、I、II期与III、IV期比较,x 2=8.58,PO.01。14n63,●7O8坨侉88OO7他m如5 低、未分化腺癌与高、中分化腺癌比较,x 2=12.45,P0.01。HA测定结果:1.胃癌与良性胃病及正常献血员血清HA的比较见表5表5各组血清HA水平比较(单位:ng/m1)2.癌肿部位与血清HA的关系见表6表6血清HA水平与癌肿部位的关系(单位:ng/m1)胃癌血清HA水平与癌肿部位间差异均无显著性,提示胃癌血清HA水平的高低与其部位无关。 表7血清HA水平与癌细胞分化程度的关系(单位:ng/m1)高、中分化腺癌组与低、未分化腺癌组之间血清HA水平没有显著性差异。4.血清HA水平与胃癌分期的关系见表8表8血清HA水平与胃癌分期的关系( 单位...